Некропто́з () — программируемая некротическая гибель клетки, сопровождаемая активацией взаимодействующей с рецептором протеинкиназы-3 (). На молекулярном уровне при некроптозе происходит строго регулируемая сборка внутриклеточного комплекса, известного как некросома, запускаемая рецепторами смерти (например, рецептором фактора некроза опухоли 1 (TNFR1), рецепторами лигандов и TRAIL), поверхностными Toll-подобными рецепторами, а также механизмами, распознающими присутствие в цитоплазме вирусных РНК. Для некроптоза, индуцируемого фактором некроза опухоли (TNF), необходима дальнейшая активация (RIP1) и . Блокирование этих киназ некростатинами, например, некростатином 1, ингибирующим RIPK1, делает некроптоз невозможным. В отличие от апоптоза, вызываемого активацией каспазы 8, некроптоз может протекать лишь при инактивации этого фермента. При некроптозе также происходит образование активных форм кислорода в митохондриях, однако, в отличие от апоптоза, не происходит фрагментация ДНК. Кроме того, в отличие от апоптоза, некроптоз сопровождается сильным иммунным ответом: погибающая клетка высвобождает молекулярные фрагменты, ассоциированные с повреждениями, которые активируют иммунитет. Некроптоз может запускаться в тех случаях, когда апоптоз по тем или иным причинам невозможен. В отличие от молекулярных путей апоптоза, изучаемых уже много лет, молекулярные основы некроптоза в настоящее время мало изучены.

Морфологически некроптоз характеризуется набуханием клетки, нарушением работы митохондрий, увеличением проницаемости плазматической мембраны и высвобождением содержимого клетки во внеклеточное пространство.

Функциональное значение некроптоза может заключаться в защите организма от внутриклеточных инфекций, однако некроптоз играет ключевую роль и в развитии многих заболеваний: инфаркт миокарда, атеросклероз, ишемически-реперфузионное повреждение, панкреатит, воспалительные заболевания кишечника, а также в ряде других распространённых нарушений.

История В 1998 году было показано, что клетки мышиной фибросаркомы L929 после обработки ингибитором каспаз zVAD-FMK быстро погибают при инкубации с фактором некроза опухоли (). Эти данные указывали на возможность того, что каспазы участвуют в защите клетки от гибели путём некроза под действием TNF. В ходе дальнейших исследований была описана эта новая форма клеточной гибели, обладающая многими признаками некроза и происходящая при активации рецепторов смерти. Путём внесения в клетки серпина и CrmA, ингибитора каспазы 8, было показано, что ингибирование каспазы 8 приводит к данной форме гибели клетки, названной некроптозом, или программируемым некрозом. До этого некроз считался случайной и нерегулируемой формой клеточной гибели, однако к настоящему времени известно несколько типов программируемого некроза.

Молекулярные механизмы

Инициация

Некроптоз индуцируют несколько рецепторов смерти, среди которых TNFR1, TNFR2 и Fas. При связывании со своими агонистами рецепторы смерти, в зависимости от условий, направляют клетку или к гибели, или к выживанию. Первоначально считалось, что рецепторы смерти могут индуцировать только апоптоз, однако затем было показано, что они могут вызвать и некроптоз при участии RIPK1, когда апоптоз невозможен. Было также показано, что агонисты Toll-подобных рецепторов () вызывают независимый от каспаз некроз. Кроме того, оказалось, что несколько генов, участвующих в сигнальных путях TLR, участвуют и в сигнальных путях некроптоза, поэтому, возможно, сигнальный путь TLR может быть задействован в некроптозе. Последний может быть запущен и через внутриклеточные стимулы, например, ДНК-зависимые регуляторные факторы интерферона () и .

Поскольку существует несколько различных инициаторов некроптоза, непонятно, имеют ли они общие последующие стадии сигнального пути некроптоза. Наиболее хорошо изучен некроптоз, инициируемый TNF-α/TNFR. Молекулярные механизмы некроптоза, запускаемого TNFR, подробно обсуждаются ниже.

Формирование комплекса I TNF-α продуцируется активированными макрофагами и представляет собой гомотримерный белок, каждая из субъединиц которого содержит 157 аминокислотных остатков. Хотя TNF-α обычно рассматривается как активатор апоптоза, он способен вызывать некроз опухолевых клеток. В начале второго десятилетия XXI века были получены доказательства того, что TNF-α способен индуцировать программируемый некроз.

TNFR1 или TNFR2, локализованные на поверхности клетки, служат специфическими рецепторами TNF-α. Поскольку TNFR2 лишён домена смерти, в запуске индуцируемых TNF-α сигнальных каскадов внутри клетки ключевую роль играет TNFR1.

Сначала TNF-α связывается с внеклеточной частью TNFR1, аллостерически вызывая конформационные изменения в его внутриклеточной части. TNFR1 содержит четыре домена, обогащённых цистеином (). Первый CRD, известный как домен сборки до связывания с лигандом (), необходим для сборки рецептора, который может связываться с TNF-α с высоким сродством. После связывания с TNF-α из внутриклеточного домена TNFR1 при помощи различных ферментов и белков высвобождается сайленсер домена смерти (SODD). После этого TNFR1 и TNFR2 запускают дальнейшие этапы сигнального пути, образуя комплекс I с белками, содержащими домен смерти, например, (), FADD (), а также несколькими Е3 убиквитинлигазами, такими как TRAF2/5 () и (IAP): и . Убиквитинирование этих белков важно для регуляции активности комплекса I.

RIPK1 — член семейства взаимодействующих с рецептором протеинкиназ (RIPK), для которых характерно наличие гомологичного N-концевого киназного домена. Степень убиквитинированности RIPK1 определяет, будет ли она выступать как молекула, способствующая выживанию клетки, или же как киназа, запускающая смерть клетки. Сначала RIPK1 рекрутируется в комплекс I под действием TNFR1 и полиубиквитинируется белками TRAF2/5, cIAP1 и cIAP2 по позиции лизин 63. Убиквитинирование RIPK1 приводит к рекрутированию и активации белков и , а также способствует активации пути NF-κB, и в конечном счёте клетка выживает. Активация пути NF-κB положительно регулирует экспрессию таких анти-апоптотических генов, как A20 и . Деубиквитинирование RIPK1 может подавить путь NF-κB, что приводит к активации путей гибели клетки. Было показано, что в регуляции пути NF-κB через деубиквитинирование RIPK1 принимают участие два белка. Один из них — белок (цилиндроматоз) — кодируется геном-супрессором опухолей Cyld. Он блокирует активацию пути NF-κB, удаляя полиубиквитиновые цепочки, связанные с остатком лизина 63, у нескольких белков-мишеней. Опухолевые клетки с неактивным CYLD демонстрируют увеличенную пролиферацию и сниженную интенсивность апоптоза. Другой белок, А20, удаляет убиквитин, связанный с остатком лизина 63, запуская протеасомную деградацию Е3 убиквитинлигаз, таких как TRAF2 и белки cIAP, и подавляет путь NF-κB по механизму отрицательной обратной связи (напомним, путь NF-κB активирует образование этого белка). Хотя убиквитинирование RIPK1 необходимо для активации пути NF-κB, необходимости в киназной активности RIPK1 здесь нет. Поэтому ключевым элементом регуляции TNF-индуцированного пути NF-κB является статус убиквитинирования RIPK1 вне зависимости от киназной активности этого белка. Комплекс I находится на пересечении путей выживания и гибели клетки, переключаясь между различными сигнальными путями в ответ на различные стимулы.

Формирование комплекса IIа Когда деубиквитинирование окончено, RIPK1 высвобождается из комплекса I и попадает в цитоплазму, откуда рекрутируется в комплекс IIа. Кроме того, после перемещения внутрь клетки (интернализации) TNFR1, связанного с лигандом, из комплекса I высвобождается TRADD; TRADD строго необходим для формирования комплекса IIa. Интернализация TNFR1, связанного с лигандом, необходима для формирования комплекса IIa: в 2010-е годы было показано, что подавление интернализации TNFR1 приводило к устойчивости клеток к апоптозу. Комплекс IIa, также известный как или DISC, состоит из TRADD, FADD, RIPK1, FLIP и прокаспазы 8. Нокдаун CYLD подавляет TNF-индуцированный некроптоз, что свидетельствует о том, что деубиквитинирование RIPK является важным шагом в TNF-индуцированном некроптозе. Однако нет никаких доказательств необходимости других деубиквитинирующих белков, например А20, для некроптоза. Подавление белков cIAP ускоряет формирование комплекса II, так как степень убиквитинированности RIPK1 становится меньше. Было показано, что другая Е3 убиквитинлигаза, TRAF2, необходима для TNF-α-индуцированного некроптоза, потому что клетки TRAF2−/− были к нему нечувствительны. Возможно, это обусловлено тем, что TRAF2 необходима для формирования комплекса I. FADD является одним из доменов, рекрутируемых в комплекс IIa, и его эффект на некроптоз зависит от типа клетки. В частности, он необходим для некроптоза, индуцированного TNF-α, в мышиных эмбриональных фибробластах (MEF), но не в лейкемических клетках . У Т-клеток в пролиферативной фазе FADD выступает отрицательным регулятором некроптоза. Механизм, обуславливающий различные роли FADD, остаётся непонятным. Имеются данные, что TRADD необходим для всех случаев некроптоза, кроме тех, которые вызываются миметиками белка . Поэтому необходимость TRADD для некроптоза зависит от стимула, вызвавшего его. Комплекс IIa может вызывать два последующих варианта развития событий: апоптоз или некроз. Белок FLIPL, который положительно регулируется путём NF-κB, образует гетеродимер с прокаспазой 8. FLIP структурно очень похож на каспазу 8, однако не обладает протеазной активностью. Комплекс IIa начинает работать про-апоптотическим образом: гомодимеры прокаспазы 8 подвергаются быстрому аутопротеолизу, в результате чего каспаза 8 активируется, диссоциирует от комплекса IIa, активирует каспазы 3 и 7, и начинается апоптоз. Каспаза 8 разрезает и инактивирует RIPK1, RIPK3 и CYLD, предотвращая некроптоз. Разрезание RIPK1 каспазой 8 не только противодействует стимулирующей роли RIPK1 в активации пути NF-κB, но и оказывает негативный эффект на некроптоз, поскольку киназная активность RIPK1 необходима для некроптоза. Кроме того, под действием стимулов, запускающих апоптоз, RIPK3 разрезается каспазой 8 по положению Asp328, подавляя способность RIPK3 индуцировать независимую от каспаз клеточную смерть. Когда апоптоз заблокирован, преобладает некроптоз.

Отсутствие FADD, FLIP или каспазы 8 у мыши приводит к смерти через 10,5 дня, однако смерти не происходит, если мыши предварительно были лишены RIPK3. Тканеспецифичная делеция FADD или каспазы 8 тоже приводит к смерти (в зависимости от типа ткани), однако этот эффект тоже может быть предотвращён отсутствием RIPK3. Исходя из этого, делается вывод, что комплекс FADD-каспаза 8-FLIP необходим для предотвращения некроптоза, зависимого от RIPK3. Именно поэтому наиболее часто некроптоз определяют как программируемый некроз, зависимый от RIPK3.

Формирование комплекса IIb Когда белки cIAP разрушены (например, в присутствии миметиков Smac), имеет место несколько иной сигнальный путь некроптоза. Миметики Smac усиливают Е3 убиквитинлигазную активность cIAP1 и cIAP2, связываясь с их (), что в конечном счёте приводит к аутодеградации этих белков. Когда cIAP разрушены, канонический путь NF-κB активируется в значительно меньшей степени, а неканонический путь NF-κB, напротив, становится очень активен. Комплекс I, содержащий TNFR1, усиленно переходит в комплекс IIb, также известный как рипоптосома, образование которого зависит не от TRADD, как в случае комплекса IIa, а от RIPK1. В итоге путь NF-κB активируется неканонически, и гибель клеток усиливается. Как и комплекс IIa, комплекс IIb может вызывать как апоптоз, так и некроптоз, что определяется наличием или отсутствием каспазы 8.

Формирование некросомы