mini|300px|Genska terapija in vivo i ex vivo 300px|thumb|desno|Jedan od modela genske terapije ex vivo a – biopsija stem ćelija b – aplikacija retrovirusnog vektora za transfer normalnog genac – rekombinantna DNK sa transferiranim normalnim genom d – inkorporiranje genetički transformiranih ćelija (Prema: Mader, 2000.)Mader S. S. (2000): Human biology. McGraw-Hill, New York, ; . Genska terapija obuhvata niz in vivo, ex vivo i in vitro metoda i postupaka za prekomponiranje postojećih i unošenje funkcionalnih kopija gena, koji zamjenjuju ili nadopunjuju (ne)aktivnost alelnih varijanti koje su odgovorne za mnoge bolesti.
Već općepoznati nazivi kao što su: genetičko inženjerstvo, genska manipulacija, gensko kloniranje, tehnologija rekombinantne DNK, DNK kloniranje, genetička modifikacija, molekulsko kloniranje, gensko inženjerstvo, pa i “nova genetika”, opisuju istoznačne pojmove u oblasti biotehnologije na bazi genetičkog inženjerstva. Svi se odnose na istovjetan proces: svrsishodni prijenos ciljanih djelića i molekula DNK iz jednog organizma u samoreplicirajuće genetičke strukture drugog, tj. transgenezu. Takvi transgeni dijelovi DNK se kasnije mogu u potrebnoj količini kopija propagirati u “stranoj ćeliji domaćinu”. Pored genetičkog inženjerstva na molekulskoj razini, već su odavno u primjeni i manipulacije većim kompleksima genetičkog materijala – hromosomima i kompletnim genomima (označene kao hromosomsko i genomsko inženjerstvo).Bajrović K, Jevrić-Čaušević A., Hadžiselimović R., Ed. (2005): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, .Kapur Pojskić L., Ed. (2014): Uvod u genetičko inženjerstvo i biotehnologiju, 2. izdanje. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, .Hadžiselimović R., Pojskić N. (2005): Uvod u humanu imunogenetiku. Institut za genetičko inženjerstvo i biotehnologiju (INGEB), Sarajevo, . Molekulsko-genetički osnovi genske terapije Osnovne komponente strategije molekulsko–genetičkog inženjerstva su: isijecanje, mijenjanje i ugradnja DNK molekula in vitro, prijenos i predstavljanje isječenih segmenata donorske DNK (gena) u recipijenta – putem odgovarajućih vektora, razvoj rekombinovanih DNK molekula u domaćinu putem vektor sistema (koji omogućuje kloniranje rekombinantnih DNK molekula) i izbor odgovarajućih DNK sekvenci.
Razvoj tehnologije rekombinatne DNK omogućuje neslućene oblike primjene novih terapijskih metoda, naročito u oblasti genske terapije i transplantacije. Tako se u istraživačke svrhe već se primjenjuje terapeutsko embrionalno kloniranje, koje predstavlja proces izgradnje genetički izmijenjenih ljudskih ćelija i tkiva. Polazni cilj razvoja ovog procesa nije kloniranje integralnih ljudskih organizama, nego “uzgajanje” stem (matičnih, neizdiferenciranih) ćelija koje se mogu koristiti za razvoj terapeutskih programa u novim pristupima kod liječenja oboljenja. Stem ćelije su veoma bitne za biomedicinska istraživanja, jer mogu proizvesti gotovo sve naknadno specijalizirane ćelije u ljudskom organizmu. Izdvajaju se nakon pet dana od iniciranja diobe – u fazi blastocita. Prilikom izdvajanja dolazi do razaranja embriona, što sve češće postaje tema pravnih, etičkih i drugih rasprava.
Ovakva genska terapija je moguća prilikom liječenja određenih genetičkih kontroliranih poremećaja uvođenjem vektora koji “unose” izmijenjene kopije “pogrešnih” gena u ćelije domaćina. Tehnologija terapeutskog kloniranja se u budućnosti može koristiti i kao izvor cijelih organa iz ćelija ili za proizvodnju zdravih ćelija. One mogu zamijeniti defektne ćelije u nekim degerativnim poremećajima, liječenju srčanih oboljenja, kancera, Alzheimerove i drugih bolesti.
Vektori unosa gena u genskoj terapiji Vektori u genskoj terapiji mogu biti virusnog i nevirusnog porijekla. Najčešći i najprikladniji virusni vektori su retrovirusi, adenovirusi, adeno–asocirani i herpes virusi, a od neviralnih – liposomi, lipopleksi i "gola" DNK. Liposomi su mikroskopski sitni mjehurići koji nastaju spontano kada se lipoproteini rasprše u tečnosti. U lipidne micele se mogu inkapsulirati molekule DNK (gen), a lipopleksi su mnogo razvijenije – virusolike stukture. Direktna upotreba "gole" DNK primjenjuje se samo u nekim slučajevima, jer je nedovoljno učinkovita.
Mikroinjektiranje, biolistika, elektroporacija i infuzija su novije tehnike genske terapije, koje nadopunjuju ili mijenjaju primjenu pomenutih nevirusnih vektora. Direktno ubrizgavanje DNK u tkivo primaoca obavlja se putem posebnih igala. Drugi metod takve procedure je tehnika specifičnog bombardovanja mikroprojektilima (biolistika). Vrlo mali dijelovi (4 μm) načinjeni od zlata ili volframa se oblože (inkapsuliraju) molekulama DNK i posebnim pištoljem (uz veliku početnu brzinu) "upucavaju" u ćelije ili tkiva. Metalne partikule (mikroprojektili) prodiru kroz ćelijski zid i membranu i ne oštećuju ih, a pri tom nastaju pore koje su dovoljnih dimenzija za ulazak strane DNK u unutrašnjost ciljane ćelije. Ovim putem se uspješno mijenjaju više biljke, alge, gljive i prokarioti, uključujući i promjenu hloroplasta i mitohondrija. Ovaj metod intervencije in vivo obećava nove mogućnosti primjene i u genskoj terapiji.
Elektroporacija se uspješno koristi kod mijenjanja mikroorganizama i biljaka, a sastoji se od toga da se silama električnog polja otvaraju pore na ćelijskoj membrani, kroz koje strana DNK može ući u citosol. Zatim se izmijenjene stanice podvrgavaju odabiru (na hranljivoj podlozi), gdje se dijele samo one koje su primile stranu DNK, dok ostale ugibaju. U aplikaciji ovog metoda najčešće se tretiraju protoplasti, kalus i zreli embrioni. Očekuje se da bi ova tehnika mogla biti uspješna i u specifičnim zahvatima genske terapije. Receptor–medijacijska endocitoza je relativno jednostavsn metod infuzijskog prijenosa, koji podrazumijeva da se DNK objedini sa ciljanom molekulom, koja se može vezati na površini posebnog ćelijskog primaoca. Taj kompleks zatim inducira endocitozu i unosi izmijenjenu ćeliju.
Strategija i modeli genske terapije thumb|300px|Ilustracija strategije zamjene oštećenih gena.
Svaka identifikacija i karakterizacija genetičkih oštećenja otvara logično pitanje mogućnosti tretmana pogođenih pacijenata. Ako se oštećeni gen može transgeno zamijeniti funkcionalnom kopijom koja nema oštećenja, takva bolest se može uspješno spriječiti i liječiti. Taj pristup se označava kao genska terapija i jedan je od iznimno obećavajućih aspekata u primjeni genske tehnologije u medicini.
Genska terapija obuhvata sve oblike sprečavanja i liječenja bolesti kod kojih se pacijentu unose normalni geni koji ispravljaju neispravnosti kod mutantnih gena – odgovornih za određene bolesti. Može se primijeniti raspoloživim in vivo ili ex vivo metodima. U toj oblasti postoje dva glavna moguća pristupa: primjena izmijenjenih gena u somatskim ćelijama inficiranog tkiva i unošenje takvih gena u reproduktivne (germinalne, germ) linije ćelija.
Ovi pristupi u genskoj terapiji mogu da imaju razne etičke posljedice. Većina naučnika i doktora somatsku gensku terapiju smatra prihvatljivom u mjeri koja (u moralnom pogledu) nije problematičnija od primjene bilo kojeg klasičnog lijeka. Međutim, kada je riječ o genskoj terapiji u liniji germinativnih ćelija, ona je neprihvatljiva za većinu stručnjaka i šire javnosti i zbog rizika narušavanja evolucijske ravnoteže u genskom fondu populacije i ljudske vrste uopće.
Uspješnost odabranog protokola genske terapije uglavnom zavisi o ostvarenju nekoliko glavnih preduslova. Gensko oštećenje mora biti uočeno, a raspoloživi gen kloniran u obliku koji je primjenljiv u namjenskim kliničkim programima. Neophodno je osigurati raspoloživ sistem primjene gena u ciljno tkivo pacijenta – unošenjem DNK sekvence (putem odgovarajućeg vektora) u ciljane ćelije. Nezaobilazan je i pogodan mehanizam pristupa ciljnom tkivu ili organu bilo udisanjem, putem injekcije ili neke druge slične metode. Ako su prethodni uslovi ispunjeni, (tj. struktura nefunkcionalnog gena izmijenjena) u ciljnoj ćeliji će se ispoljiti struktura unešenog gena.
U idealnim okolnostima, oštećeni gen bi bilo moguće zamijeniti funkcionalnom kopijom. Takva gensko–zamjenska terapija je jednaka rekombinaciji između oštećene i unesene kopije. Alternativa joj je primjena gensko–adicijske terapije, kojoj nisu potrebni uslovi srazmjerne zamjene genskih sekvenci, jer se funkcije unosnog gena samo pridružuju učincima oštećenog. Ovakav pristup je djelotvoran samo pod uslovom da oštećeni gen nije dominantan, jer u tom slučaju on kodira oštećeni protein koji prekriva svaki efekat unesenog recesivnog transgena. Terapija dominantnog gena se može izvesti upotrebom antisens iRNK (tako da reverzna kopija gena proizvodi antisens konfiguraciju iRNK).
Komplikacije mogu nastati zbog ciljnih ćelija i tkiva. U nekim situacijama je moguće izdvojiti ćelije iz pacijenta i manipulirati njima van tijela, a zatim se oštećene ćelije pacijenta zamijene funkcionalno obnovljenim u ex vivo tretmanu. Ova metoda je pogodna za gensku terapiju bolesti krvnog sistema, ali ne i za liječenje solidnih tkiva, kao što su plućna, pankreasna, koštana i druga – gdje se primjenjuje metoda in vivo.
Genska terapija in vivo počiva na unošenju terapeutskih gena u organizam pacijenta putem mogućih prenosnih–sistema: virusa, kultura ćelija ili drugih sintetičkih vektora unesenog gena. Liposomi sa genima za kontrolu cistične fibroze se u ljudski organizam mogu unijeti sprej–tehnikom inhalacije (u nozdrve). Retrovirusi u koje su ugrađeni antikancerski geni su ubrizgani direktno u maligni tumor uz očekivanje kurativnih efekata. U tim pokušajima već su zabilježeni primjeri uspješnih intervencija. Također se očekuje da bi genska terapija in vivo mogla biti uspješna i u tretmanu hemofilije, dijabetesa, Parkinsonove bolesti ili AIDS–a. U slučaju hemofilije, u organizam pacijenta se unose regularne ćelije sa normalnim genom za proizvodnju koagulacijskih faktora. Takve ćelije se mugu ubrizgati i u organoide, tj. vještačke organe koji se usađujju u organizam pacijenta. Za liječenje Parkinsonove bolesti neophodne su ćelije koje proizvode dopamin u svrhu njihovog direktnog unosa u mozak. U novije vrijeme istražuju se mogućnosti direktnog mijenjanja oštećene DNK sekvence pacijenta sa nasljednom bolešću.
Izbor metoda genskog prenosa ovisi o prirodi ciljanog tkiva i metoda primjene: posredstvom ćelija u kulturi (ex vivo) ili direktno u ćelije pacijenta (in vivo). U principu, nijedan od sistema genskog transfera nije idelan niti univerzalan, jer svaki od njih ima posebne mane i ograničenja.
Genska terapija ex vivo uključuje sve oblike genetičke transformacije molekula, ćelija ili organa u vantjelesnim uslovima i unošenja tako izmijenjenih proizvoda u organizam pacijenta. Još prije desetak godina (1993.) je potvrđena njena opravdanost i učinkovitost Široko i detaljno je opisivan primjer takvog liječenja kompleksne imunodeficijencije (SCID) kod jedne djevojčice (Cindy Cutshall). Ovakva genska terapija počiva na ideji da je moguće pacijenta snabdjeti nedostajućim genom ili zamjenom oštećenog. Pacijentovim leukocitima je u kulturi ex vivo, dodan gen za korekciju nedostajuće funkcije oštećenog gena, a zatim su ponovo vraćeni u njegov organizam. Zabilježeno je da tako uneseni gen (ADA) još uvijek funkcionira.
Ovaj model genske terapije je primijenjen i u tretmanu AIDS–a, kancera, cistične fibroze, hiperholesterolemije i drugih bolesti. Iako u nekim slučajevima ćelije pacijenta nisu prihvatile adekvatan broj aktivnih manipuliranih gena, razvojem dostatne procedure, genska terapija ex vivo bi uskoro mogla spašavati živote miliona ljudi.