frame|Uszkodzenie DNA doprowadziło do licznych pęknięć chromosomów Naprawa DNA – szereg procesów prowadzących do identyfikacji i naprawy zmian w cząsteczkach DNA w żywej komórce. W komórkach organizmów żywych procesy metaboliczne i czynniki środowiskowe mogą powodować uszkodzenie DNA. W każdej komórce codziennie ma miejsce nawet milion takich uszkodzeń. Wiele z nich powoduje trwałe zmiany w cząsteczce DNA, które mogą upośledzić albo pozbawić komórkę możliwości prawidłowej transkrypcji genu kodowanego przez uszkodzony fragment DNA. Inne uszkodzenia mogą skutkować potencjalnie groźną dla genomu komórki mutacją, dotyczącą tej komórki i wszystkich następnych powstałych z niej po podziałach. Oznacza to, że proces naprawy DNA w komórce musi być cały czas aktywny, by móc szybko i skutecznie niwelować skutki każdego uszkodzenia komórkowego DNA.
Powodzenie naprawy DNA zależy od wielu czynników, w tym typu i wieku komórki oraz środowiska pozakomórkowego. W komórce, w której duża ilość DNA uległa uszkodzeniu albo której mechanizmy naprawy DNA nie są wystarczająco efektywne, mogą zajść: nieodwracalny stan wygaśnięcia aktywności komórki – starzenie się komórki; samobójcza śmierć komórki, czyli apoptoza; niekontrolowane podziały, prowadzące do powstania nowotworu.
Zdolność komórki do naprawy własnego DNA jest istotna dla integralności fizycznej całego genomu oraz integralności informacji genetycznej, którą niesie, a więc i dla prawidłowego funkcjonowania całego organizmu. Wiele genów które początkowo zidentyfikowano jako wpływające na długość życia komórek, z czasem okazały się być zaangażowane w procesy naprawy i ochrony DNA przed uszkodzeniem. Nieprawidłowy przebieg naprawy zniszczeń komórkowych w komórkach generatywnych może doprowadzić do propagacji mutacji w gametach i w rezultacie, przekazania mutacji potomstwu. Z drugiej strony, między innymi takie mutacje są siłą napędową ewolucji biologicznej.
Uszkodzenie DNA Uszkodzenie DNA na skutek procesów metabolicznych wewnątrz komórki i czynników środowiskowych, występuje z szacowaną częstością 1000 do 1 000 000 pojedynczych uszkodzeń cząsteczek DNA na komórkę każdego dnia. Stanowi to jedynie 0,000165% ludzkiego genomu składającego się z około 6 miliardów zasad (3 miliardów par zasad), ale nienaprawione uszkodzenia w krytycznych dla funkcji komórki genach (takich jak geny supresorowe nowotworów) może upośledzić zdolność komórki do pełnienia jej funkcji i znacznie zwiększyć prawdopodobieństwo transformacji nowotworowej.
Duża część uszkodzeń cząsteczek DNA, najczęściej związanych z chemiczną modyfikacją zasad, objawia się zaburzeniem pierwszorzędowej struktury podwójnej helisy. Zmodyfikowane zasady zaburzają regularny przebieg helisy poprzez wprowadzenie dodatkowych, nienaturalnych wiązań chemicznych czy zawady sterycznej, która poprzez fizyczne niedopasowanie wypacza strukturę helisy. W przeciwieństwie do białek czy RNA, DNA zazwyczaj nie posiada istotnej dla funkcjonalności struktury trzeciorzędowej dlatego zaburzenia zwykle nie występują lub są nieistotne na tym poziomie organizacji strukturalnej. Jakkolwiek nić DNA jest zazwyczaj zwinięta do postaci superzwiniętej (ang. supercoiled), a jej upakowanie jest wspomagane przez oddziaływania z histonami – te oddziaływania, jak i struktura superzwinięta mogą być zaburzone przez uszkodzenia DNA.
Źródła uszkodzenia Uszkodzenia DNA mogą być podzielone na dwie duże grupy:
endogenne uszkodzenie, spowodowane m.in. przez działanie reaktywnych form tlenu powstających w prawidłowych procesach metabolicznych komórki, zwłaszcza w procesie oksydacyjnej deaminacji; egzogenne uszkodzenie, spowodowane przez takie czynniki, jak: promieniowanie ultrafioletowe (o długości fali λ=200–300 nm); inne zakresy promieniowania elektromagnetycznego, zwłaszcza promieniowanie rentgenowskie i gamma; hydroliza; działanie wysokiej temperatury; niektóre wirusy; pewne toksyny roślinne; mutageny, zwłaszcza związki aromatyczne; radioterapia i chemioterapia stosowane w leczeniu chorób nowotworowych.
Replikacja uszkodzonego DNA przed podziałem komórkowym może doprowadzić do błędnego włączenia nieprawidłowych zasad do DNA i przekazania mutacji komórkom potomnym. Na tym etapie prawidłowy zapis kodujący geny tych odcinków DNA jest już niemożliwy do odtworzenia, ze względu na brak oryginalnej, nienaruszonej matrycy (nieuszkodzone DNA). Wyjątkiem są bardzo rzadkie przypadki mutacji przywracających pierwotną, prawidłową strukturę DNA (mutacje wsteczne, rewersja mutacji).
Typy uszkodzeń Wyróżnia się cztery główne typy uszkodzeń DNA spowodowane endogennymi procesami metabolicznymi w komórce: utlenianie zasad azotowych (np. oksydacja guaniny do 8-oksoguaniny) i przerwania nici DNA spowodowane działaniem reaktywnych form tlenu; alkilowanie zasad azotowych (zazwyczaj metylacja), np. utworzenie 7-metyloguaniny; hydroliza zasad, np. deaminacja, depurynacja, depirymidynacja; wstawienie niekomplementarnej zasady (ang. mismatch) w czasie replikacji DNA.
Uszkodzenie spowodowane egzogennymi czynnikami może mieć różny charakter. Przykładami są: promieniowanie ultrafioletowe powoduje tworzenie wiązań między sąsiadującymi zasadami cytozyną i tyminą, prowadząc do utworzenia dimerów pirymidynowych; promieniowanie jonizujące utworzone podczas rozpadów radioaktywnych albo promieniowanie kosmiczne powoduje przerwania nici DNA; podwyższona temperatura powoduje zwiększenie częstości depurynacji i przerwań pojedynczych nici DNA. Przykładowo, hydrolityczna depurynacja zachodzi u termofilnych bakterii Thermus thermophilus HB27 żyjących w gorących źródłach w temperaturze 85–250 °C z tak dużą częstością (depurynacja 300 nukleotydów purynowych na genom na generację), że mechanizmy naprawy DNA nie są wydolne, stąd nie można wykluczyć możliwości odpowiedzi adaptacyjnej u tego gatunku; przemysłowe związki chemiczne takie jak chlorek winylu albo nadtlenek wodoru, i naturalne, takie jak węglowodory policykliczne (występujące m.in. w dymie, sadzy i smole) prowadzą do powstania różnorodnych pochodnych zasad azotowych – etenowych, utlenionych, alkilowanych fosfotriestrów i innych, a także powodują utworzenie nieprawidłowych wiązań poprzecznych (ang. crosslinking) między nićmi DNA.
Uszkodzenie DNA jądrowego a uszkodzenie DNA mitochondrialnego W komórkach organizmów eukariotycznych, a więc również ludzkich, DNA znajduje się poza jądrem komórkowym także w mitochondriach (u roślin dodatkowo w chloroplastach). DNA jądrowy (nDNA, ang. nuclear DNA) występuje w postaci chromatyny podczas niereplikatywnych etapów cyklu komórkowego i jest upakowany w zwarte struktury znane jako chromosomy w czasie podziału komórki. W każdej z tych form DNA jest silnie skondensowany i owinięty wokół kompleksów białkowych o paciorkowatym kształcie, zbudowanych z białek zwanych histonami. Gdy komórka chce odczytać informację genetyczną zakodowaną w jej własnym DNA właściwy fragment chromosomu jest rozwijany, odczytywane są znajdujące się tam geny, a następnie łańcuch powraca do swej pierwotnej formy. Mitochondrialny DNA (mtDNA), znajdujący się w mitochondriach, istnieje w wielu kopiach, jest również ściśle związany z pewną liczbą białek, z którymi tworzy kompleks zwany nukleoidem. Wewnątrz mitochondriów reaktywne formy tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species) oraz wolne rodniki, produkty uboczne mitochondrialnych etapów oddychania komórkowego, tworzą silnie utleniające środowisko uszkadzające mtDNA. Enzym zwalczający nadmiar nadtlenków w środowisku to dysmutaza ponadtlenkowa, obecna zarówno w mitochondriach, jak i cytoplazmie komórek eukariotycznych.
Starzenie się i apoptoza komórki Starzenie się, nieodwracalny proces prowadzący do zaprzestania mitotycznych podziałów komórki, jest skorelowany z procesem skracania zakończeń chromosomów, tak zwanych telomerów. Telomery są długimi fragmentami powtarzającego się niekodującego DNA, które „zamykają” kod genetyczny na końcach ramion chromosomów. Podczas każdego podziału komórki telomery poddawane są częściowemu uszkodzeniu, skracaniu. (powiązane jest to z istnieniem tzw. limitu Hayflicka), które skorelowane jest ze stopniowym starzeniem się komórki. Oprócz samego skracania telomerów, realizowanego przez enzym telomerazę, prawdopodobnie uszkodzenia DNA per se także pełnią rolę w „komórkowym odliczaniu czasu życia”. Wskazuje na to między innymi fakt, że uszkodzenia DNA oraz skracanie telomerów dzielą ze sobą te same mechanizmy odpowiedzi komórkowej. Starzenie się komórek może funkcjonować jako użyteczna alternatywa dla apoptozy, zwłaszcza tam, gdzie fizyczna obecność komórki jest z różnych powodów potrzebna organizmowi. Używa on mechanizmu „ostatniej szansy”, aby powstrzymać komórkę z uszkodzonym DNA przed dzieleniem się w niewłaściwy sposób przy braku pobudzających wzrost sygnałów komórkowych (ang. cellular signaling). W opozycji, przejście w stan spoczynku jest odwracalnym stanem wstrzymania aktywności komórki, niepowiązanym z jakimikolwiek uszkodzeniami genomu (patrz cykl komórkowy).
Mechanizmy naprawy DNA Komórki nie mogą funkcjonować, jeśli uszkodzenia DNA są na tyle poważne, że naruszają ciągłość lub zmieniają sens istotnej informacji genetycznej (ang. essential genes). Jakkolwiek komórki mogą funkcjonować jeśli uszkodzone są geny nieistotne (ang. non-essential genes), czyli takie, których uszkodzenia nie powodują śmierci komórki. Komórka działająca z takimi uszkodzeniami DNA może jednak wykazywać inne właściwości od komórek zdrowych (skrajnym wypadkiem są komórki nowotworowe) lub jej funkcje mogą być mocno upośledzone. Zależnie od typów uszkodzeń, które zaszły w dwuniciowej strukturze DNA, w toku ewolucji wykształciło się wiele strategii naprawczych, mających za zadanie kompensować i likwidować uszkodzenia. Jeśli jest to możliwe, komórki używają zazwyczaj nieuszkodzonej nici komplementarnej lub chromatydy siostrzanej jako matrycy do odtworzenia oryginalnej informacji na uszkodzonym elemencie komplementarnym. W przypadku braku takiej możliwości, używany jest awaryjny mechanizm syntezy DNA, zwany TLS (ang. Translesion DNA Synthesis).
Uszkodzenia DNA niosą zazwyczaj ze sobą zmianę organizacji przestrzennej helisy. Kiedy uszkodzenie jest już zlokalizowane, na miejsce zdarzenia rekrutowane są białka naprawcze, wiążące się z samym miejscem uszkodzenia lub w jego sąsiedztwie i które rekrutują następnie kolejne elementy kompleksów naprawczych. Uszkodzenia są usuwane przez takie złożone, wieloelementowe kompleksy specyficznych białek. Zależnie od typu uszkodzenia, a także od fazy cyklu komórkowego, w którym aktualnie znajduje się komórka, takie kompleksy mają różny skład podjednostkowy.
Bezpośrednia naprawa uszkodzenia Znane są trzy typy uszkodzeń DNA eliminowane przez mechanizmy komórkowej naprawy DNA bezpośrednio przez chemiczną modyfikację uszkodzenia bez użycia matrycy w postaci nieuszkodzonej informacji genetycznej. Każdy z tych typów uszkodzenia może dotyczyć wyłącznie jednego rodzaju zasady azotowej, wobec tego możliwe jest specyficzne usunięcie takiego uszkodzenia. Należą do nich: reakcja fotoliazy, katalizującej reakcję naprawy dimerów tymidynowych (rodzaj dimerów cyklobutylowych) powstałych wskutek działania promieniowania UV na sąsiadujące zasady tymidynowe – tworzy się nieprawidłowe wiązanie kowalencyjne. Reakcja fotoreaktywacji katalizowana przez fotoliazę zależna jest od energii absorbowanej z przedziału UV-L (λ=300–500 nm). reakcja metylotransferazy metyloguaninowej (MGMT, bakteryjny odpowiednik ogt), katalizującej reakcję demetylacji metylowanych zasad guaninowych. Proces ten jest kosztowny dla komórki, ponieważ każda reakcja enzymatyczna zużywa jedną cząsteczkę enzymu, który nie może już katalizować następnych reakcji. W zasadzie nie jest to więc reakcja katalityczna, a zwykła stechiometryczna. Uogólniona odpowiedź bakterii na związki metylujące jest odpowiedzią adaptacyjną i odzwierciedla poziom odporności na ciągłą ekspozycję na czynniki alkilujące.